سل کانتر(Cell Counter)

سل کانتر(Cell Counter)

دستگاه  سل کانتر یکی از پرکاربردترین و اصلی ترین تجهیزات آزمایشگاهی هستند.

با این دستگاه می توان تعداد گلبول های قرمز (RBC)، گلبول های سفید (WBC)   و پلاکت هارا اندازه گیری کرد. علاوه براین برخی از این

دستگاه ها قابلیت اندازه گیری هموگلوبین ، هماتوکریت (MCHC,MCH,MCV)، مرفولوژی گلبول های قرمز را نیز را دارند و تعداد اندکی از آنها

شمارش افتراقی سلول های سفید (شمارش تعداد لنفوسیت ها، مونوسیت ها، گرانولوسیت ها ) را انجام می دهند.

وظیفه ی گلبول های قرمز انتقال اکسیزن و دی اکسید کربن بین بافت ها و ریه ها است. شمارش RBC ، تعداد گلبول های قرمز را در یک میکرولیتر از خون نشان می دهد.

پارامتر دیگر ، HCT است که حجم سلول های خون را نسبت به حجم کل خون نمونه بیان می دارد. سل کانتر الکترونیکی که مشخصات خون را

اندازه گیری می کنند به دو گروه اصلی تقسیم می شوند:

گروه اول در هنگام عبور خون از مقابل یک منفذ، تغییرات امپدانس الکتریکی محلول را اندازه گیری می کنند و گروه دوم، برمبنای شکست نور در اثر عبور سلول خون کار می کنند.

امروزه نسل جدید این سل کانترها قادر به اندازه گیری 22 پارامتر مختلف هستند که مهم ترین قابلیت آن ها افتراق 5 زیر گروه سلولی گلبول های سفید است.

دستگاه قادر به اندازه گیری 10000 سلول در هر نمونه است.اگر تعداد گلبول های سفید کوچکتر از 10 کیلو بر میکرولیتر باشد، سیستم همان

تعداد سلول هارا به عنوان WBC کلی شمارش خواهد کرد.

این سیستم ها علاوه بر شمارش متداول سلول های خونی ، قادر به انجام شمارش افتراقی سلول ها ، محاسبه ی پارامتر های مرتب با اندازه

سلول و مشخص کردن نمونه های غیر طبیعی هستند.

اصول کار دستگاه

سل کانترهای الکترونیکی که مشخصات خون را اندازه گیری می کنند به دو گروه اصلی تقسیم می شوند:

گروه اول در هنگام عبور خون از مقابل یک منفذ، تغییرات امپدانس الکتریکی محلول را اندازه گیری می کنند و گروه دوم، بر مبنای شکست نور در اثر عبور سلول خون کار می کنند.

شمارنده سلول امپدانس الکتریکی

در این تکنیک در سل کانتر ابتدا نمونه خون گرفته شده را با اضافه کردن داوری ضد انعقاد هپارینه کرده تا از به هم چسبیدن سلول ها و ایجاد خطا در اندازه گیری اجتناب شود.

سپس با مکش خودکار حجم مشخصی از خون وارد دستگاه می شود. سپس، نمونه به نسبت ۱ به ۲۲۴ با محلولی که از نظر اسمزی با خون

ایزوتونیک و بدون ذرات معلق است، رقیق می شود، در نهایت نمونه رقیق شده به دو قسمت تقسیم می شود.

یک قسمت وارد محفظه شده و قسمت دیگر که برای شمارش RBC استفاده خواهد شد، دوباره به یک محفظه رقیق کننده برگردانده می شود.

به قسمتی از خون که برای شمارش WBC مورد استفاده می گیرد محلولی به نام ماده لیز کننده اضافه شده که غشاء سلول های قرمز را پاره کرده و هموگلوبین را آزاد می کند.

اندازه گیری هموگلوبین

برای اندازه گیری هموگلوبین در سل کانتر مقداری از محلول سیانید و پتاسیم فری سیانید، به عنوان ماده لیز کننده به نمونه اضافه می‌شود.

سیانید آهن، آهن هموگلوبین را از حالت فرو ۲+ (Fe) به حالت + ۳ (Fe) تبدیل کرده و مت هموگلوبین ایجاد می‌کند که با سیانیدپتاسیم ترکیب

می شود و رنگدانه پایدار “سیان مت هموگلوبین” را تولید می کند.

چگالی نوری محلول با روش های اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود و مقدار به دست آمده متناسب با غلظت هموگلوبین است.

پس از رقیق کردن نمونه ها، شمارش WBC,RBC و پلاکت با تکنیک امپدانس سنجی حجمی به دست می آید. برای شمارش سلول های قرمز

نیز از همین روش استفاده می شود. محلول های شامل سلول ها وارد محفظه شمارش می‌شود.

سپس حجم مشخصی از محلول متوسط پمپ خلاء و از طریق منفذ وارد لوله شمارش می شود. یک الکترود داخل لوله است و الکترود دیگر در محفظه شمارش قرار دارد.

هنگامی که سلول از منفذ عبور می کند جریانی از محلول بدون سلول که از جلوی منفذ می گذرد، جریان الکتریکی ثابتی را بین دو الکترود به

وجود می آورد و حجمی از محلول را برابر حجم خودش جابجا می کند. در سل کانتر مقاومت سلول مفید خیلی بزرگتر از مقاومت مایع است.

در نتیجه با عبور سلول خون، وقفه ای در جریان و یک پالس امپدانسی ایجاد می شود. دامنه پالس متناسب با حجم سلول است. پالس ها

تقویت می‌شوند و پالس هایی که امپدانس آن ها بیشتر از یک سطح آستانه باشد، شمرده خواهند شد.

افزایش دقت اندازه گیری

در سل کانتر برای افزایش دقت اندازه گیری، از سه واحد شمارش به صورت موازی استفاده می شود. این سه واحد، از یک محفظه شمارش و

الکترود محفظه مشترک استفاده می کنند، ولی هر کدام لوله شمارش و الکترود لوله مخصوص خود را دارند.

خروجی هر واحد تقویت می شود و از مدار آستانه عبور می کنند. ولتاژ آستانه در هنگام کالیبره کردن به دست می آید.

پالس هایی که  بیشتر از سطح آستانه هستند، وارد انتگرال گیر می شوند تا ولتاژ dc متناسب با تعداد WBC تولید شود. خروجی های سه مدار

انتگرال گیر وارد مدار تصمیم گیری می شود.

اگر سه خروجی در یک محدوده باشند، متوسط آن‌ها گرفته می شود.

اگر یکی از مقادیر، از دو مقدار دیگر مقدار  خیلی دور باشد، در میانگین گیری به حساب نمی آید و اگر سه مقدار خروجی خیلی با یکدیگر تفاوت

داشتند، خطا گرفته می شود و خروجی صفر خواهد بود.

معمولا بیش از یک سلول در یک لحظه از جلوی منفذ عبور می کند که این  امر باعث ایجاد خطا در شمارش می شود. در بیشتر آنالایزرها، با

استفاده از روش های آماری این پدیده را پیش بینی و اصلاح می‌کنند.

شمارنده سلول لیزری

در سل کانتر هنگامی که سلول ها از جلوی نور لیزر با طول موج خاص در حال عبور هستند، آشکارسازهای الکترونیکی، نور پراکنده شده از سلول را اندازه گیری می‌کنند

. نوری که در جهت مستقیم پراکنده می شود همان طول موج نور تابش شده را دارد و شدت آن با اندازه ذره متناسب است.

به این ترتیب که هر چه سلول بزرگ تر باشد، پراکندگی نور بیشتری وجود خواهد داشت و دتکتور FSC سیگنال بزرگ تری را به سمت قسمت

الکترونیکی می فرستد. از آنجا که این نور به حد کافی قوی است برای شناسایی آن از فتودیود استفاده می‌شود.

در ادامه :

فرض هموژن بودن سلول ها در مورد RBC ها نسبتا صادق است، ولی برای WBC ها مناسب نیست و برای تعیین اندازه RBC ها نیز به دلیل

متفاوت بودن اشکال آنها و تفاوت در محتوای هموگلوبین دچار محدودیت خواهیم شد.

برای حل این مشکل در مورد RBC ها آنها را در محیط‌های با غلظت مناسب به شکل کره در آورده و شدت تفرق نور در زوایای مختلف را مقایسه می کنند.

امروزه نسل جدید این سل کانترها قادر به اندازه گیری ۲۲ پارامتر مختلف هستند که مهم ترین قابلیت آنها افتراق ۵ زیر گروه سلولی گلبول های سفید است.

دستگاه سل کانتر قادر به اندازه گیری ۱۰۰۰۰ سلول در هر نمونه است. اگر تعداد گلبول های سفید کوچک تر از ۱۰ کیلو بر میکرولیتر باشد،

سیستم همان تعداد سلول ها را به عنوان WBC کلی شمارش خواهد کرد.

این سیستم ها علاوه بر شمارش متداول سلول های خونی، قادر به انجام شمارش افتراقی سلول ها، محاسبه پارامترهای مرتب با اندازه

سلول و مشخص کردن نمونه های غیر طبیعی هستند

دلایل خطا در شمارش گلبول های خون

خطا در جمع آوری یا نگهداری نمونه به شیوه نامناسب در سل کانتر

نمونه گیری از بیمار دیگر

 نمونه خون با برگه درخواست بیمار دیگر

رقیق بودن نمونه، مثلا نمونه از محلی گرفته می شود که در بالاتر از آن تزریق وریدی انجام می شود.

استفاده از EDTA بسیار غلیظ ( ایجاد چروکیدگی گلبول های قرمز و کاهش کاذب هماتوکریت )

لخته شدن قسمتی از نمونه ( وجود لخته های ریز و کوچک در نمونه )

 غلیظ بودن نمونه به علت استفاده طولانی از تورنیکت (بیش از یک دقیقه)

 همولیز نمونه

 بیش از حد گرم شدن یا منجمد کردن نمونه

نمونه ی خون کهنه

خطا در برداشت نمونه توسط دستگاه

خطا در شست و شوی اولیه و آماده سازی دستگاه سل کانتر  ( سبب شمارش زمینه ای بالای شمارنده در زمان شروع کار می شود )

سایر مزایای این دستگاهها

این دستگاههای سل کانتر  با رنگ آمیزی پراکسیداز گلبولهای سفید، گلبول های نرمال را از غیرنرمال افتراق می دهند. این دستگاه های سل

کانتر با استفاده از رنگ آمیزی گرانولهای داخل سلولی نوع گلبولهای سفید را دقیقا افتراق (Diff) نموده و درصد آنها را بیان می نمایند.

مقدار سلولهای نارس یا بلاست(Blast) را نشان می دهند که برای تشخیص لوسمی ها و لنفوم ها وکم خونی ها بسیار حائز اهمیت می باشد.

برخی از آنها رتیکولوسیت را نیز می شمارند که در مانیتورینگ کم خونی مهم است.

برای اطلاعات بیشتر بر روی این لینک کلیک نمائید.

Cell Counter

This plugin will open a new cell counter GUI. On the left are the counter types and counters, on the

right the action buttons .

Bugs

May not work correctly after using Load Markers to load more than 8 counter types from an XML file.

Opens off-screen on 1024 pixel wide and smaller monitors.

Functions

• Initialize:

• Initializes the current image or stack for counting, this will create a duplicate image/stack titled “counter window” – when keep original is checked, the source image remains open

• Add:

• adds a counter type.

• Remove:

• removes the last counter type.

• Delete mode:

• toggles between insert and delete mode. When checked, the marker of the currently selected  type closest to the mouse cursor will be deleted when you click.

• Delete:

• delete the last placed marker.

• Reset:

• reset all counters to 0.

• Results:

• Shows the counter results in the ImageJ results table. In case of a stack the counts per slice and the totals are displayed.

• Save Markers:

• Exports the marker data to an XML file – Only available when running java 1.4 or higher

• Load Markers:

• Loads stored marker data from an XML file – – Only available when running java 1.4 or higher

• Export Image:

• Makes a copy of the counter image with the markers written on it (only the current slice is copied in case of a stack)

• Measure…:

• Measures the pixel value at each marker and displays a result window showing: Type – Slice – X coordinate – Y coordinate – Pixel Value

Preparing hemocytometer

1. If using a glass hemocytometer and coverslip, clean with alcohol before use. Moisten the coverslip with water and affix to the hemocytometer. The presence of Newton’s refraction rings under the coverslip indicates proper adhesion.

2. If using a disposable hemocytometer (for example, INCYTO DHC-N01), simply remove from the packet before use.

Preparing cell suspension

Aseptic technique prevents contamination of cell cultures and reagents by microorganisms.

Watch our aseptic technique video protocol here that shows you how to sterilize work areas and use

appropriate sterile handling techniques, personal protective equipment, and good hygiene.

1. Gently swirl the flask to ensure the cells are evenly distributed.

2. Before the cells have a chance to settle, take out 0.5 mL of cell suspension using a 5 mL sterile pipette and place in an Eppendorf tube.

3. Take 100 µL of cells into a new Eppendorf tube and add 400 µL 0.4% Trypan Blue (final concentration 0.32%). Mix gently.

Counting

Using a pipette, take 100 µL of Trypan Blue-treated cell suspension and apply to

the hemocytometer.

  If using a glass hemocytometer, very gently fill both chambers underneath the coverslip, allowing

the cell suspension to be drawn out by capillary action.

If using a disposable hemocytometer, pipette the cell suspension into the well of the counting

chamber, allowing capillary action to draw it inside.

Using a microscope, focus on the grid lines of the hemocytometer with a 10X objective.

Using a hand tally counter, count the live, unstained cells (live cells do not take up Trypan Blue) in

one set of 16 squares (Figure 1).

When counting, employ a system whereby cells are only counted when they are set within a square

or on the right-hand or bottom boundary line. Following the same guidelines, dead cells stained

with Trypan Blue can also be counted for a viability estimate if required.

Move the hemocytometer to the next set of 16 corner squares and carry on counting until all 4 sets of 16 corners are counted